A maneira mais facil de obter culturas assépticas de Azevinho para micropropagação é pelo isolamento e cultura de embriões Zigóticos, retirados da semente. Esta tecnica é tambem valida para outras espécies de Ilex. É uma tecnica pratica pois a sementes são robustas e permitem uma desinfecção grosseira com lixiva e alcool etílico ou alcool etílico e água oxigenada, sem que se danifiquem os embriões. A desvantagem está principalmente no trabalho laborioso de abrir as sementes e isolar os embriões à lupa e em camara de fluxo laminar. Uma outra desvantagem será o facto de por ser dioica ser impossivel determinar o sexo das plantas micropropagadas o que é mau visto que apenas as femeas produzem a atractiva baga vermelha. Em todo o caso existem hoje um sem número de variedades hermafroditas que podem ser igualmente clonadas por esta técnica. -E é tambem sabido que as plantas germinadas in vitro têm melhor capacidade de enraizamento e um crescimento mais acentuado.
Para isolamento dos embriões é conveniente deixar as sementes em água durante cerca de dois dias, e trata-las com um antifungico por duas a três horas antes da desinfecção mais agressiva com os outros desinfectantes. O antifungico que tenho usado é o "Switch" da Syngenta que se tem mostrado um excelente substituto do muito aclamado em cultura de tecidos "Benlate".
Após a remoção dos embriões que se encontram sempre num dos extremos da semente estes devem ser colocados com a ajuda do bisturi imediatamente na superfície do meio. O meio adequado é o WPM (Woody Plant Medium) com adição de 20g/L de sacarose 7g/L Agar de nivel técnico, e Ph ajustado para 5,8. As placas de petri nas quais se podem inocular um grande numero de embriões devem depois ser colocadas no escuro durante cerca de 3 samanas a uma temperatura de cerca de 22 graus ao fim das quais já se poderão ver os primeiros primordios foliares de algumas das plantulas.-Não é aconselhavel colocar demasidos embriões numa só placa pois uma infecção numa placa pode destruir varias horas de trabalho. Depois de desenvolvidas as plantulas e na fase de propagação, as infecções em azevinho são raras dado que esta espécie produz alcaloides com propriedades antibióticas. Ja pensei em fazer culturas mistas com espécies mais susceptiveis, mas ainda não testei este metodo.
Propagação
A propagação de Ilex é feita exactamente nas mesmas condições apenas com adição de 1mg/L de BAP e remoção da raiz dos explantes. Já li mais do que uma vez que os azevinhos podem ser multiplicados prolificamente em meio liquido em recipientes tipo biorreactor mais ainda não testei este método.
The easyest way available to obtain asseptic cultures of Iex aquifolium for micropropagation, is by isolation and culture of zigótic embryos extracted from the seeds. This tecnhique is also valuable for other Ilex species.
It is a pratical method for obtaining fast growing cultures because the hard seeds can be roughly desinfected without damaging embryos thus obtaining a contaminant free culture.
The disadvantage of this technique is the hard labour involved in opening the seed and isolating the embryo from seed endosperm, under a stereomicroscope. Another theoretical disadvatage is the fact that as an ornamental plant only the females produce the atractive red coloured fruits. On the other way, cultures coming from this technique have much more vitality and rooting capacity than ones taken from shoots colected in adult plants, and since a number of monoic species within the genre are currently available the second disadvantage tends to disapear.
For isolation of the embryos it is advisable to leave the seeds in water for a couple of days before the desinfection process (to soften the seed coat), wich can be made with bleach, ethil alcool and/ or hidrogen peroxide combinated. Also it is advisable to use an antifungal agent in the seeds after the removal of the pulp, lately i´ve been using"Switch"by Syngenta wich has a combination of a systemic and a superficial active principle, it works fine as a substitute of the widely aclaimed in tissue culture "Benlate".
After removal of the embryos they should be imediately layed on the surface of the medium wich is the WPM formulation (Woody Plant Medium) added with 20g/L of sucrose 7g/L agar of technical grade and PH adjusted to 5,8.
The Petri dishes, in wich you can easily fit as many embryos as you want, should then be placed in the dark for about 3 weeks at a temperature of 22 degres celcius, after wich you will see some plants already displaying the first set of leaf primordia.- It is not advisable to overcroud the petri dishes with embryos since a single infection can waste hours of precious work.
After development infections in Ilex cultured flasks are rare because Ilex is though to pocess some antibiotic alcaloids. I am even thinking of testing mixed in vitro cultures with this species to naturally fight infections in other cultures. You can go ahead and try that for me if you want :).
Propagation
To start multiplying your established in vitro cultures of Ilex, all you have to do is cut the root of the explants and transfer them to the exact same medium but with 1mg/l of BAP.
I have reed more than once than Ilexes are suitable for culture in liquid medium bioreactors but i havn´t tryed it yet. As soon as i know more i will publish....
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